中国肺炎研究网(CAP-China)最新研究揭示人感染H7N9禽流感病毒蛋白的关键位点在患者体内动态变化规律
作者：中日友好医院呼吸与危重症医学科 临床微生物与感染实验室 邹晓辉
近日，中国肺炎研究网(CAP-China)最新研究揭示人感染H7N9禽流感病毒蛋白的关键位点在患者体内动态变化规律，相关研究于2018年4月24日在线发表于美国感染病协会(IDSA)官方杂志《感染性疾病杂志》(J Infect Dis)。
链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29688498
该研究由中日友好医院曹彬教授团队联合苏州大学附属第一医院，南昌大学附属第一医院完成。
科学问题
人感染禽流感H7N9自2013年在中国东南地区出现以后，迅速传播至其他多个省份。初期H7N9病毒对禽类低致病性，对人高致病性。自2017年1月初，广东地区发现了血凝素（HA）剪切位点突变的高致病性H7N9病毒。截止至2017年10月，H7N9病毒已造成全球1,565人感染，患者死亡率高达39%。
H7N9属于分节段的RNA病毒，不仅容易发生变异，还可通过不同亚型间不同片段之间的互换发生重配变异。H7N9病毒在我们持续进化和变异，并与中国禽类中广泛传播的H9N2病毒不断发生重配不断产生新的基因型，并形成了珠三角和长三角两个传播源头。
H7N9病毒蛋白的关键位点，如耐药性相关位点NA 292，哺乳动物适应位点PB2 627，在H7N9病毒感染人及其致病性方面起着关键作用。但是，H7N9病毒在感染患者体内经历的变化，特别是在抗病毒治疗情况下的变异，依然并不清楚。
研究方法
本研究收集了中日医院，江苏大学第一附属医院，南昌大学第一附属医院的H7N9患者11名，动态采集患者的呼吸道样本，对其中的H7N9病毒进行二代测序。观察患者不同疾病进程时期病毒关键位点的变异，统计变异的野生型序列的比例，进而推算病毒的动态变异。
研究结果
H7N9病毒在同一患者体内的保守性
本研究共获得11名患者的29份样本的H7N9全基因组组序列，其中9名患者具有多个时间点的病毒序列信息。所有患者都进行了奥司他韦抗病毒治疗，部分患者还接受了帕拉米韦和激素治疗。病毒进化分析显示，同一患者的病毒在进化上呈现保守性，患者间的病毒多样性高于患者内病毒多样性。
图1 H7N9病毒的进化分析
抗病毒治疗下的耐药性变异
基于病毒的全基因组序列，本研究解析了H7N9病毒的神经氨酸酶（NA）上所有耐药位点变异信息，包括R118K（N2规则计数，NA蛋白118位点由精氨酸R突变为懒氨酸K，下同），E119V，D151E，R152K，I222V，R224K，H274Y，E276D，R292K，N294S，和R371K。R292K是最多的耐药性突变，在5名患者的9份样本中检测到。在所有发生R292K突变的患者中，均为敏感的野生型292R和耐药的突变型292K混合存在。在2号和11号患者中，耐药性突变292K出现后又消失。在7号和9号患者中，耐药性突变292K毒株与292R混合存在，尽管在这个时期患者一直在进行抗病毒治疗，对奥司他韦敏感的耐药性毒株一直存在并未被清除掉。值得注意的是，9号患者第一份样本即发现了大量的耐药性突变，而这个时期患者并未开始抗病毒治疗，说明部分患者的耐药性突变并不是在抗病毒药物选择压力下产生的。H274Y突变是流感病毒另外一个常见的耐药性突变，在一名患者的一份样本中检测到。其他耐药性相关位点未发生突变。
图2. H7N9病毒耐药性位点R292K和哺乳动物适应位点PB2 E627K动态变化
哺乳动物适应位点的变异
患者H7N9病毒的PB2 627位点同样发生中动态变化，该位点由谷氨酸E突变为赖氨酸K时常常导致禽流感病毒对哺乳动物的适应性和毒力升高。在患者3和6中，PB2 627K突变最终消除了野生型病毒627E。但在患者10和11中，PB2 E627K表现出了动态变化。在患者10中，野生型（E）和突变型（K）的比例在患者近10天的病程中变化不明显，在患者11中，野生型和突变型的比例发生着波动和反复，且在观察的最后一个时间点，突变型病毒未能取得优势。
其他片段上的关键位点变异
HA, PB1，PA，和NS1上的关键位点变异很少，很少出现野生型和突变型共存的现象。
结论
H7N9病毒在患者体内发生着动态变化，NA 292 和PB2 627位点是变异的“热点”区域。尽管在神经氨酸酶抑制剂选择压力下出现了耐药性突变，但野生型耐药病毒株依然存在。同样的，尽管PB2 E627K和D701N双突变可增强病毒的哺乳动物适应性，但这种双突变并未在患者中筛选出来。
研究意义：
1. 本研究所采用的动态采集呼吸道标本进行二代测序和分析的方法，为未来进一步研究H7N9禽流感病毒在宿主内的进化提供了重要思路。
2. 本研究证明H7N9耐药野生型病毒株存在，对神经氨酸酶抑制剂作为一线抗病毒药物的地位提出了挑战，并呼唤新的不同作用机制的抗流感病毒药物。
3. 虽然本研究并没有观察到H7N9病毒在宿主体内持续的适应性突变，但是由于例数少，现在下结论为时尚早。未来禽流感病毒哺乳动物的适应性突变仍需要继续密切监测，为流感大流行提供早期预警。
致谢：感谢中日医院临床微生物实验室全体工作人员，感谢中国国家流感中心杨磊教授对数据分析的帮助。本研究得到国家杰出青年科学基金和国家重点研发计划的支持。
